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本试剂盒用于从动物细胞或组织中分离出完整而纯化的线粒体。适合于动物软组织（肝或脑组织）和硬组织（肌肉）以及培养细胞线粒体DNA的提取制备。不适合植物及其他标本的提取。

线粒体DNA提取的关键是尽可能的去掉核DNA。本试剂盒利用差速离心得到比较纯净的线粒体，再利用DNA酶消化和裂解缓冲系统等多步骤去掉核DNA，最后得到纯净的线粒体DNA。可用于PCR等对纯度要求较高的实验。

• 为保证获得完整及尽可能多的线粒体，匀浆条件要示：第一是全程低温操作。第二是快速。第三，如用条件可将匀浆后的碎片在显微镜下观察。与组织块相比，培养细胞特别是贴壁培养细胞在用玻璃匀浆器匀浆时较难破壁，因而要选用小容量玻璃匀浆器、间隙严密的研杵上下研磨培养细胞。
  
• 线粒体DNA本身含量很低，如果电泳检测不到，可加大上样量，用更少量的TE溶解沉淀，或者直接进入PCR检测。
  
• 以离心力g计算正确的离心速度，不同的离心机可据此精确计算离心速度。一般低温度心机都有离心力显示，如果没有，可以用以下公式简单的换算。
  
  
  G＝1.11×(10^-5)×R×[rpm]²
  
  G为离心力，一般以g（重力加速度）的倍数来表示；[rpm]²即：转速的平方；R为半径，单位为厘米。

• 使用前，在DNase I中加入600μL的DNA酶反应液，分装后-20℃保存三个月，如果超过三个月，活性可能会降低，请自行订购DNase I。
  
• 线粒体裂解液保存于常温，如有沉淀37℃水浴溶解，离心机温度下降到4℃（2～8℃），如无低温离心机，也可以常温离心，并将离心时间为10min的改为5min，但最后所得DNA品质及产量可能会有一定影响。

• 样本处理
  
  • 组织匀浆：称取100～200mg新鲜组织如肝脏、脑、心肌等，PBS或生理盐水冲洗，洗净血水，滤纸吸干，用剪刀剪为碎块放入小容量玻璃匀浆器内。加入1mL冰预冷的细胞裂解液，0℃冰浴上下研磨组织20次；
    
  • 培养细胞匀浆：消化细胞，PBS洗涤，800×g 5～10min离心收集细胞。计数。每次提取需要5×10⁷个细胞，加入1.0mL冰预冷的细胞裂解液重悬细胞，将细胞悬液转移到小容量玻璃匀浆器内，0℃冰浴研磨30～40次；
• 将组织或细胞匀浆物转移到离心管，4℃，1000×g离心5min；
  
• 取上清，加入一新的离心管中，4℃，1000×g再次离心5min。
  
• 取上清，加入一新的离心管中，4℃，12000×g离心10min。离心后的上清含胞浆成分，可从中提取胞浆蛋白。将上清转移到新离心管，线粒体沉淀在管底；
  
• 在线粒体沉淀中加入0.5mL线粒体清洗液重悬线粒体沉淀，4℃，1000×g离心5min；
  
• 取上清，加入一新的离心管中，4℃，12000×g离心10min。弃上清，高纯度的线粒体沉淀在管底；
  
• 加入100μL DNA酶反应液重悬线粒体，吹打均匀后，再加入10μL DNase I溶液（见准备工作），混匀，37℃水浴10min。此步为消化线粒体表面吸付的核DNA。4℃，12000×g离心5min。尽可能的弃上清，再加入200μL TE重悬线粒体沉淀，4℃，12000×g离心5min，洗去残留的DNA酶。
  
• 得到的沉淀，用200μL TE缓冲液重悬线粒体沉淀，加入10μL RNase A。加入200μL线粒体裂解液，轻轻混匀（不可吹打），放置1～2min，再加入150μL蛋白沉淀液，迅速混匀。4℃，12000×g离心5min。此步骤可进一步去除核DNA。
  
• 取上清，加入一新的离心管中（如用于酶切分析，可加入此步：选用等体积的酚氯仿异戊醇25:24:1抽提一次，再用氯仿抽提一次，或者直接用氯仿抽提两次，一般来说，此步可去掉一些微量蛋白及糖类，但会造成线粒体DNA的损失，因而用于PCR时可省，并不影响后续实验），加入0.6倍体积的异丙醇（如无异丙醇，可加入2.5倍体积的乙醇沉淀DNA，如离心管太满可分两管）及5～10μL核酸核酸助沉剂，混匀，-20℃沉淀半小时左右（此步可省），4℃，12000×g离心10min。
  
• 弃上清，再加入1mL 70%乙醇清洗，4℃，12000×g离心5min。重复用70%乙醇洗一次。
  
• 弃上清，再次离心1min吸弃上清，不要碰到管底，开盖凉干约5～10min。
  
• 加入20～30μL TE缓冲液，轻弹管底，37℃水浴5分钟，线粒体DNA溶解。
  
• 进行DNA电泳检测及-20℃保存，进行下步的实验。